[病虫手册]-柑桔黄龙病检测
时间:2018-12-27 02:38:15 来源:加拿大预测55 作者:匿名


国家农业网新闻:柑橘黄龙病检测PCR技术

柑橘黄龙病是一种世界性的毁灭性疾病。控制这种疾病的关键在于:1。严格检疫,防止患病的接穗和幼苗扩散; 2.建立无病苗基地,培育无病苗; 3.尽早消灭病株并控制柑橘木槿。这些方法的有效实施需要紧急和准确的检测技术组合。由于黄龙病的病原体在病变体内(特别是在病株中)非常低,以前的检测方法(包括化学方法和血清学方法)对于检测这种低浓度的病原体不够灵敏。 。聚合酶链式反应(PCR)是Saiki等人开创的DNA体外扩增技术。它是一种通过体外酶促反应合成特定DNA的方法。它使用特异性引物在极端温度变化条件下在几小时内将非常少量的目标DNA片段扩增到一百万次,从而实现可检测的目的。根据我们几年的实验,PCR方法是一种快速准确检测柑橘黄龙病病原菌的新技术。测试程序和方法如下:

首先,提取样品DNA

使用CTAB方法(Murray等人,1980)提取样品的模板DNA。具体操作如下:取0.5g静脉,切成片,加入液氮??制成粉末,加入2-3倍体积的2%CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取缓冲液,混匀,在Eppedorf管中分配,水浴于65℃1小时,用苯酚/氯仿和氯仿/异戊醇萃取1-2次,取上清液,加入1/10体积的3mol/L NaAC(即乙酸钠)(pH7.0)和2倍体积的绝对浓度乙醇,置于-20℃过夜,16000转/分钟,心脏在4℃下分离20分钟,弃去上清液,分别用70%和95%乙醇洗涤,一次用气球干燥样品并离开在室温下保持5分钟,干燥DNA沉淀。加入100μLTE溶解DNA沉淀,在1.2%琼脂糖凝胶上电泳2μLDNA,在紫外灯下观察DNA纯度,估算浓度。其余的储存在-20°C以备后用。二,引物设计

基于柑橘黄龙病病原体亚洲菌株In-2.6(Villechanoux等1993)的DNA序列设计PCR引物引物1(P1)和引物2(P2),扩增片段大小为535bp。

三,PCR扩增反应

PCR反应体系的总体积为50μL。反应体系包括5μLPCR反应缓冲液,5μL2mmol/L dNTP,1μLP1和P2,2μL模板DNA(每次反应10 ng),35μL灭菌双蒸水,最后1次将μL的Taq DNA聚合酶(3U /μL)混合并置于PCR机器上以进入扩增反应。反应条件如下:在94℃变性5分钟后,通过在94℃变性1分钟→在55℃退火1分钟→72℃退火1分钟进行循环(需要最后一次) 10分钟)。

四是检测扩增产物

将10μLPCR扩增产物在1.2(g/L)琼脂糖凝胶上电泳,并在紫外灯下观察结果。只有感染柑橘黄龙病病原体的样本才能扩增出535 bp的特异性电泳区,扩增阳性(图)

五元,

柑橘黄龙病的PCR检测结果不仅可以检测到病变枝条附近无症状分支中症状的存在和黄龙病的存在,还可以检测出苗圃中已经患病但尚未出现症状的症状。 。病变菌株(图2)。因此,PCR技术对柑橘黄龙病的早期诊断可以有效地防止病株的传播,对培育无柑橘病苗和防治黄龙病具有重要的应用价值。

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